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RT-PCR检测方法的具体步骤

更新时间:2020-07-08 13:22点击:

  

  1、根据标本数4102量分装RLT液:从Kit中取出RLT液,用1.5mL离心管1653分装,每管500μL(在体系配制区操作)。

  2、在生物安全柜内将采样液(鼻拭子、咽拭子、胸水等)或病毒培养物(鸡胚尿囊液或细胞培养液)取100μL加入RLT液管中,充分混匀。 3、每管分别加入5μL β-巯基乙醇,混匀后依次加入600μL 70%的乙醇,充分混匀。

  4、从Kit中取出带滤柱的2mL收集管,打开包装将其做好标记。取步骤(3)中的混合液600μL加入滤柱中,12000rpm,离心15s,弃收集管中的离心液。

  5、滤柱仍放回收集管上,将步骤(3)剩余的混合液全部吸入滤柱中,12000rpm,离心15s,弃离心液。

  10、12000rpm,离心1min,收集离心液即为提取的病毒RNA,立即做实验或-20℃以下保存。

  阴性对照:无菌水(标本RNA提取时,跟标本同时提取无菌水。) 阳性对照:已知病毒RNA

  2、PCR反应体系配制(在体系配制区配反应液) 1)按下表加入试剂: PCR反应体系

  对每一个建立的反应确定反应数(n=拟进行的PCR管数,包括阴性,阳性对)。考虑到阴性无模板对照,阳性对照,误差,制备过量的反应混合物是必要的。具体如下:

  2)将上述反应液混匀,分装到0.2mL PCR小管中,每管20μL,分别做好标记。

  将上述分装好的PCR小管分别加入模板。首先加入阴性对照管(5μL无菌水),然后分别加标本RNA(每管5μL),最后加入阳性对照RNA(每管5μL)。

  将上述加好模板的反应管混匀,短暂离心后放入PCR仪进行RT-PCR 扩增。

  1)2.0%琼脂糖凝胶制备:称取2.0g Agarose,倒入耐热玻璃瓶内,再加入电泳液(1×TBE)100mL,轻轻混匀后加热,使Agarose完全熔化。待Agarose胶温度降至50~60℃左右,加入核酸染料,轻轻混匀(不要产生气泡)。待胶温度降至50℃左右时,将其倒入制胶板,插好电泳梳子。待胶完全凝固(约30~60min)之后,将梳子拔出。

  2)将制备好的电泳胶放入电泳槽(带梳子孔的一端在阴极),倒入电泳液(1×TBE)浸过胶面即可。

  3)PCR产物各取10μL,加入2μL上样缓冲液(6×Loading Buffer),混匀后加入电泳胶孔内(先加Marker(DL-2000)5μL,然后依次加标本PCR产物,再加阴性对照,最后加阳性对照产物)。 4)电泳电压100V,约30~40min后看结果。 5)将电泳胶放入凝胶成像系统观察结果并照相。

  尽量多查文献,别人如何用这种检测方法,多找几篇,类似的文章。我就是这样找的。


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