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常见猪病PCR检测操作步骤及试剂配制 (收藏)

更新时间:2020-07-08 13:22点击:

  (蓝耳病、猪瘟、乙脑、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、轮状病毒等)

  取组织病料约2克,加入4-5毫升灭菌的PBS或者生理盐水,置研磨器(灭菌)中研磨或者用剪刀细心剪碎,置-20℃中反复冻融三次,即可用于检测。

  1)取上述冻融三次的病料约200微升置1.5毫升的离心管中,加入500-600微升TRIzol剧烈振摇30秒后,静置5分钟后,再次剧烈振摇30秒后,静置5分钟。

  2)在加入200微升的氯仿,上下颠倒混匀30s,静置5分钟,4℃ 12000g离心15 min。

  离心完毕后,取上清约400-500微升(注意不要吸到中间层白色物质)置新的灭菌好的离心管中,加入等体积的异丙醇,颠倒数次后(不可剧烈震动)静置10分钟,4℃ 12000g离心10 min.可见管底部有少量白色沉淀,倒掉异丙醇,加入1毫升75%的乙醇(DEPC水配制),振摇,将白色沉淀悬浮,4℃ 7500g离心5 min。弃去上清,干燥沉淀物(将离心管倒置于卫生纸或者其它吸水纸上,室温约5 min即可)加入20μLDEPC水溶解用于RT-PCR,或于-20℃保存备用。

  设立阳性和阴性对照,阳性对照一般为病毒液,阴性对照用灭菌的双蒸水做为PCR反应模板。

  PCR反应条件为:94℃预变性3min;94℃45s,56℃45s,72℃45s,共进行36个循环;最后72℃延伸10min。(根据不同的病毒设定时间和温度)

  反应条件:50℃反转录30min,94℃预变性2min,进行30个循环(94℃变性1min,56℃退火1min,72℃延伸1min),最后72℃延伸10min。扩增完的PCR产物放4℃保存。

  0.25琼脂糖+25毫升TAE+1.25微升Goidview放入锥形瓶中,置烤箱中约1分钟沸腾后,摇匀,放置室外,约20-30分钟后倒入板中,约30-45分钟凝固后即可使用。

  取20μL PCR产物与4μL 6×Loading Buffer混匀,1%琼脂糖凝胶(GoldView 0.5ug/ml)电泳。电泳结束后,在紫外灯下切出含有目的DNA条带的琼脂糖凝胶,用纸巾吸尽凝胶表面的电泳缓冲液,此时应注意尽量切除不含目的DNA部分的多余凝胶以减小凝胶体积,从而提高DNA的回收产率。之后按照胶回收试剂盒产品说明书回收目的片段,并取1μL回收产物点样观察回收效果。

  (3)均匀混合后65℃水浴10 min,其间摇晃3-5次使胶块完全溶化;

  (5)转移液体至Spin column中,12,000rpm 离心1min,弃滤液(可将滤出液体回收再离心一次以提高DNA回收率);

  (10)将Spin column 安置于一灭菌的1.5mlEppendorf管中,在滤膜中央处加入灭菌双蒸水或者试剂盒中的洗脱缓冲液20-30微升,室温静置1-2 min;

  (11) 12,000 rpm离心1min,收集滤出液体再离心洗脱一次,即得到纯化的PCR产物。

  注:PCR纯化产物可直接用于测序,如用PCR回收产物直接测序时,回收第10步中不可用洗脱缓冲液,只可用双蒸水。

  1)取处理好的病料约1毫升置1.5毫升的离心管中,12000 rpm/min离心五分钟,取上清液(500-700μl).缴入等体积的氯仿剧烈振摇静止5分钟,12000 rpm离心10分钟,

  2)去上清至新的离心管中,加入终浓度为分别为10% 的SDS(约50微升)和50μg/ml蛋白酶K(约10微升),55℃作用1.5h-2h(提前准备好水浴锅)。

  4)取上清液,于一个新的离心管中,加入Tris饱和酚和氯仿各200uL,充分混匀, 12000 rpm/min离心15min;

  5)取上清于一新的离心管中,加入200uL氯仿,充分混匀,12000 rpm/min离心15min;

  6)去上清于新的离心管中,加入2倍体积无水乙醇,-20℃放置20min, 12000 rpm/min离心15min,弃上清。(无水乙醇提前冰浴)

  7)加入70%的乙醇(提前放入冰箱)冲洗沉淀表面和管壁,弃乙醇,晾干。(若无沉淀可以离心7500 rpm/min离心5min;

  设立阳性和阴性对照,阳性对照一般为病毒液,阴性对照用灭菌的双蒸水做为PCR反应模板。

  PCR反应条件为:94℃预变性3min;94℃45s,56℃45s,72℃45s,共进行36个循环;最后72℃延伸10min。(根据不同的病毒设定时间和温度)

  向灭菌的玻璃瓶中加入超纯水,然后加入DEPC至终浓度为0.01%(V/V)过夜搅拌(放置摇床中),高压灭菌即可。

  向烧杯中加入800毫升去离子水,充分搅拌,用浓盐酸调节PH至7.4,加入去离子水定容至1升,高压灭菌后即可使用

  1)50×TAE贮存液:Tris242g,冰乙酸28.5 ml和Na2EDTA.2H2O37.2混合,向烧杯中加入800毫升去离子水,充分搅拌,加入57.1毫升醋酸,充分搅拌,加入去离子水定容至1升,室温保存。

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